Determinarea conținutului de acid oxalic din fructe și legume prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC)

Determinarea Acid oxalic Conținutul din fructe și legume prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC)
1. Principiul experimental și proiectarea metodei
Fiind un acid organic comun în fructe și legume, conținutul de acid oxalic afectează direct gustul și valoarea nutritivă a alimentelor. Acest experiment utilizează cromatografia lichidă de înaltă performanță în fază inversă (RP-HPLC). În condiții acide de fază mobilă, acidul oxalic este separat la linia de bază de substanțele interferente folosind o coloană cromatografică C18. Un detector de ultraviolete setat la 210 nm este utilizat pentru analiza cantitativă, bazată pe caracteristicile de absorbție UV ale grupărilor carboxil din moleculele de acid oxalic.
2. Curba standard și pregătirea probei
Pentru prepararea soluțiilor standard se utilizează o metodă de diluție în gradient: se cântăresc cu precizie 25,0 mg de acid oxalic dihidrat și se diluează până la 25 ml cu apă ultrapură pentru a obține o soluție stoc de 1 mg/ml. Aceasta se diluează secvențial într-o serie de soluții standard la 50, 100, 200, 400 și 800 µg/ml, fiecare concentrație fiind injectată în triplicat.
Pentru prepararea probei se utilizează extracția asistată de microunde: se cântăresc 5,00 g de omogenat de fructe/legume, se adaugă 10 mL de soluție de acid clorhidric 0,1 mol/L, se tratează la 60°C cu microunde timp de 10 minute, se filtrează printr-un filtru cu membrană de 0,45 µm și se colectează filtratul pentru testare.
3. Optimizarea condițiilor cromatografice
Faza mobilă este un sistem tampon fosfat dihidrogen de potasiu 0,01 mol/L (pH 2,5)-acetonitril (95:5), cu un debit de 0,8 mL/min și o temperatură a coloanei de 35°C. Ajustarea proporției de acetonitril arată că atunci când faza organică depășește 10%, timpul de retenție al acidului oxalic se scurtează la mai puțin de 3 minute, dar are loc o stagnare a vârfului. În condițiile finale optimizate, timpul de retenție al acidului oxalic este de 4,2 minute, realizând o separare completă de acidul citric și acidul malic adiacent (rezoluție > 1,5).
4. Validarea metodei
Verificarea intervalului liniar arată o relație liniară bună între aria vârfului și concentrație în intervalul 10–1000 µg/mL (R² = 0,9993). Limita de detecție (LOD), determinată prin metoda raportului semnal-zgomot, este de 0,5 µg/mL. În testele de repetabilitate, RSD pentru șase determinări repetate ale aceleiași probe de spanac este de 1,8%. Experimentele de recuperare a vârfurilor la trei niveluri (80%, 100% și 120%) dau recuperări medii de 98,2%, 102,4% și respectiv 97,8%, îndeplinind cerințele pentru analiza cantitativă.
5. Analiza probelor reale
Au fost testate șase fructe și legume disponibile comercial: spanac (356 ± 12 mg/100 g), țelină (215 ± 9 mg/100 g), roșii (18 ± 2 mg/100 g), măr (6 ± 1 mg/100 g), banană (nedetectată) și broccoli (89 ± 5 mg/100 g). O comparație cu metoda standard națională (GB 5009.277-2016) arată că abaterea relativă dintre cele două metode este mai mică de 5%, verificând fiabilitatea acestei metode. În special, metoda HPLC prezintă o sensibilitate mai mare decât metodele tradiționale de titrare atunci când se analizează probe cu conținut scăzut de acid.
6. Note cheie
Controlați cu strictețe valoarea pH-ului în timpul pretratării probei. Dacă pH-ul extractului depășește 3, precipitarea cu oxalat de calciu va duce la rezultate scăzute ale testelor. Faza mobilă trebuie preparată zilnic proaspăt pentru a evita precipitarea cu sare și blocarea coloanei. După fiecare 20 de injecții, spălați coloana cu acetonitril-apă (30:70) timp de 30 de minute pentru a preveni degradarea eficienței coloanei. Pentru probele care conțin pigmenți (de exemplu, varză mov), se recomandă adăugarea unei etape de purificare prin extracție în fază solidă înainte de injecție.
7. Instrucțiuni de aplicare și extindere
Această metodă poate fi extinsă la detectarea acidului oxalic în probe biologice precum urina și sângele. Prin ajustarea compoziției fazei mobile (de exemplu, adăugarea de hidroxid de tetrabutilamoniu), acidul oxalic și metaboliții săi pot fi determinați simultan. Combinată cu un detector de spectrometrie de masă, se poate stabili o metodă mai precisă de detectare a urmelor. În industria alimentară, această metodă poate oferi un suport important în materie de date pentru selecția soiurilor cu conținut scăzut de acid oxalic și optimizarea proceselor de gătit.